PCR檢測方法之爭——實時熒光PCR(qPCR)與環介導等溫擴增技術（LAMP)

在分子檢測當中，qPCR與LAMP是兩個比較熱門的方法。兩個技術各有擁護者，大家都覺得各自的技術是更加先進的。相信很多人都接觸或者聽說過這兩個技術，但二者之間的差別在哪里，孰優孰劣？很多人或許就沒有深入了解了。今天，我們在這里就對兩個技術做一個比較。

要了解這兩個技術的差別，首先我們要了解這兩個方法的原理。

上面是PCR擴增過程的一個簡圖，PCR擴增分為三個過程。第一，變性，通過溫度的升高，通常為94攝氏度左右，讓模板DNA雙鏈解鏈為單鏈，為接下來引物的結合提供條件；第二，退火，通過降低溫度，通常為55攝氏度左右，讓引物與單鏈DNA特異性結合，以便Taq酶進行堿基延伸；第三，延伸，再次升高溫度，通常為70-75攝氏度，Taq酶以結合到單鏈DNA上的引物的3’端為起點，以DNA鏈為模板進行延伸。然后又回到第一步變性，如此循環，目標基因片段就會得到指數倍的擴增，經過40個循環，目標基因片段可以獲得百萬倍的擴增。

在qPCR中，會在反應體系中加入熒光探針或者熒光染料，探針或者染料結合到合成的DNA鏈上，引發熒光反應，DNA合成越多，熒光的強度也就越大，通過光度計探測熒光的數值，也就可以換算出合成DNA的量，接著計算出DNA模板的起始量。這就qPCR原理的簡單描述。

接下來我們再看看LAMP法的原理。

LAMP法的關鍵是在引物的設計上。相比較普通PCR方法，LAMP法需要設計兩對引物FIP和BIP，F3和B3。這兩對引物與模板DNA在具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶于60-65攝氏度恒溫環境下，產生帶環狀結構的產物，接著引物又與環狀中的單鏈部位結合，繼續產生帶環狀的產物，如此引發目的基因的高效擴增。

LAMP法最具特色的地方是由引物的巧妙設計，不斷產生帶環狀結構產物，然后引物以環狀中的單鏈位置為結合位點，在雙鏈沒有解鏈的情況下不斷發生新鏈的合成。

由于二者的擴增過程的不同，導致二者表現出來的特點也不一樣。

 1  需要的儀器設備不同。因為LAMP法是在恒溫條件下進行擴展，所以LAMP法所需要的設備只需要一個能產生恒定溫度即可，對于儀器的要求比較低，而qPCR需要在變性、退火、延申三個不同溫度下不斷切換，所以需要一個能快速產生溫度變化的設備，這對設備的要求會比較高，因為如果儀器變溫速度不夠快，會導致非特性擴增，影響結果的準確性。所以早期的qPCR設備都很昂貴，動輒幾十萬，不過現在很多設備的價格都已經降了下來，像方舟生物的qPCR儀價格就是很實惠的了。

 2  操作過程不同。兩個方法大同小異，基本過程都如下圖所示。

DNA的提取過程都差不多，不同點主要在中間的擴增過程和后續的判讀上。因為各自擴增的特點，擴增的過程、時間和產生的產物都不一樣。LAMP法是在恒溫條件下進行的，所以只要設定一個溫度即可進行工作，qPCR則需要設定三個不同的溫度進行循環。LAMP法一般在15-60分鐘內完成，可產生10^9-10^10倍的產物，qPCR一般進行40個循環，所需時間在60分鐘內，可產生百萬倍的擴增產物。也就是說LAMP的擴增效率更高。

 3  結果判讀方式不同。qPCR通常是采用實時熒光檢測進行結果判讀，而LAMP則有多種方式，濁度法，熒光法，電泳法等。但是因為LAMP的特點，他的結果是沒有特異性的，也即是說他只是判斷是否發生擴增，而不能對非特異性擴增進行判斷，這也導致LAMP假陽性的結果比較多，且只能進行定性而不能進行定量檢測，影響LAMP大規模推廣。而qPCR可通過熒光探針的方法進行結果判讀，具有特異性和定量的特點。

 4  結果準確性。LAMP方法有兩對引物，因此其擴增的特異性比較高，但是由于其靈敏性很高（產物可達10^10倍），所以也導致LAMP的實驗環境要求很高，因為少量的污染也可能導致假陽性的產生，另外LAMP的引物濃度比較高，有時會發生引物間的配對，引發擴增，導致假陽性，這些都是影響LAMP推廣的因素。相對應的，qPCR的結果是比較可靠的。

 5  檢測通量。由于結果判讀的方式不同，LAMP一個實驗只能進行一個目的基因的檢測，而qPCR可通過引物與探針的設計，進行多通道檢測，從未實現一個實驗檢測多個目的基因。

 6  另外，LAMP對于長鏈目前基因的擴增效率比較慢，所以LAMP只能進行短鏈擴增，這也影響了LAMP的應用場景。

綜上所述，LAMP與qPCR各有優劣，但在目前對檢測結果高準確型，高通量等要求下，qPCR的應用還是更加廣一些。